Разлика между in vivo етикетиране и in vitro етикетиране

Протеомиката е нововъзникваща дисциплина, която използва различни технически средства за изучаване на протеомиката. Целта е да се анализират динамичните промени на протеиновия състав, нивото на експресия и състоянието на модификация, да се разбере взаимодействието и връзката, да се обясни функцията на гаранция и редовността на активността на клетките. Количественото определяне на протеини е точното идентифициране и количествено определяне на всички протеини, експресирани в геном или в сложна смесена система. Количественото определяне на протеини може да се използва за скрининг и търсене на различно експресирани протеини между пробите, причинени от всеки фактор. В същото време някои ключови протеини също могат да бъдат качествено и количествено анализирани. Сред тях, според количествения метод, той може да бъде разделен на относително количествен и абсолютен количествен. Според метода на етикетиране, той може да бъде разделен на метод за маркиране in vivo (SILAC) и метод за етикетиране in vitro (ICAT, AQUA). Следното е въведение към in vivo и in vitro методи за етикетиране, представляващи SILAC и AQUA.

Знаете ли SILAC?

SILAC се отнася до устойчиво маркиране на изотопи с аминокиселини в клетъчната култура, което използва основните аминокиселини главно Lys и Arg, белязани с леки, средни или тежки изотопи до културална среда, за да маркират новосинтезирани протеини в клетките. Като цяло, след пет до шест поколения, протеините в клетките ще бъдат белязани с изотопи. Протеиновите проби от различни обработки бяха смесени в едно и също количество. Количествените и качествени резултати на протеините са получени чрез SDS-PAGE разделяне, разрязване на гел, храносмилане на ензими и LC-MS / MS анализ. SILAC се използва широко в сравнителна протеомика, взаимодействие протеин-протеин, взаимодействие протеин-ДНК и взаимодействие протеин-РНК. SILAC има много предимства пред in vitro етикетирането. SILAC с висока пропускателна способност може да се използва за етикетиране на протеините в клетката. В същото време множествените протеини могат да бъдат анализирани едновременно и идентифицирани чрез масспектрометрия. SILAC изотопното етикетиране има висока ефективност, стабилност и няма влияние от разтвор на пиролиза. Резултатите са възпроизводими и надеждни. Чувствителността на SILAC е висока и количеството протеин, необходимо в експеримента, е значително намалено, а резултатите са по-близки до истинското физиологично състояние.

Знаете ли AQUA?

Методът AQUA е да се добави известно количество вътрешен стандарт на синтетичен пептид със стабилно изотопно етикетиране или вътрешен стандарт на пептиден сегмент, маркиран по химичен метод след ензимна хидролиза на тестваната проба, и да се сравни интензивността на сигнала на целевия пептиден сегмент с добавяне на вътрешния стандарт. Получава се съдържанието на целевия пептид. Тъй като вътрешният стандартен пептид лесно се получава от търговски компании, той се използва широко в абсолютна количествена оценка. Въз основа на същия принцип, in vitro изотопното маркиране на целевия пептид, като например 18O, диметилиране или mTRAQ белязан пептид, също може да се добави като вътрешен стандарт към системата, която трябва да бъде тествана, за да се реализира количественото определяне на целевия протеин.

Количествените резултати обаче са несигурни, тъй като методът е да се добави вътрешният стандарт след ензимна хидролиза на пробата, която трябва да се тества, и да се игнорира загубата, причинена от процеса на предварителна обработка на пробата. Освен това цената на този метод е висока, трудно е да се постигне голям брой целеви протеини абсолютен количествен анализ.

Знаете ли разликата между in vivo етикетиране и in vitro етикетиране?

Методът на вътрешния стандарт се отнася до избиране на подходящото вещество като материал за вътрешен стандарт, добавяне на количествено към измерената проба, междувременно съотношението на измерения компонент и площта на пика на материала на вътрешния стандарт, умножаване на корекционния коефициент и определяне на съдържанието на вътрешния стандарт добавено вещество. Предимствата на метода за вътрешен стандарт са, че хроматографските условия имат малко влияние върху резултатите, точността и точността са високи, а недостатъкът е, че е трудно да се изберат подходящи материали за вътрешен стандарт.

Външният стандартен метод се нарича също метод на стандартна крива, който се използва за измерване на съдържанието на пробата според кривата, изготвена от стандартната проба. Предимствата на външния стандартен метод са прост, подходящ и голям анализ на извадката. Недостатъкът е, че всяко хроматографско състояние е много трудно да бъде едно и също, податливо на грешки.

Обикновено използваме външен стандартен метод, когато правим анализ на лекарства in vitro и анализ на лекарства in vivo. Тъй като процедурата на извличане е тромава, всички използват метода на вътрешния стандарт, за да продължат корекцията, но ако инструментът е стабилен, възпроизводимостта на метода е добра, което също може да използва метода на външния стандарт. Има и много външни стандартни методи за анализ на лекарства в чужди страни.

Ако веществото за вътрешен стандарт се използва при одобрение на ново лекарство, трябва да се представят структурните данни за потвърждение на вътрешното стандартно вещество и да се предоставят вътрешните стандартни референтни вещества, както и производството. Така че дори експертите на SDA не препоръчват метода на вътрешния стандарт. Първоначалното използване на вътрешния стандарт се дължи на неточността на инжектора и вътрешният стандарт може да се използва за коригиране на грешката в пробата. Точността на HPLC с количествено инжектиране на контура е много висока и точността се намалява поради грешката на операцията при добавяне на вътрешния стандарт. При проверка на качеството на лекарствата, ако съставките на суровото лекарство или препарат не са много, използвайте външен стандартен метод. И сега все повече стандарти изоставят използването на вътрешни стандарти.

За анализ на лекарства in vivo, грешката на аналитичния метод не е толкова важна и на грешката, въведена в процеса на лечение с проби, трябва да се обърне по-голямо внимание. Следователно вътрешният стандарт обикновено се добавя в процеса на обработка, за да се коригира грешката. Понастоящем степента на възстановяване не е абсолютно високи изисквания. Въпреки че се изисква абсолютна степен на възстановяване от 70% или повече, понякога няма значение дали е по-ниска. Ключът е стабилността на възстановяването и възпроизводимостта на определянето.